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恒遠技術員為客戶解說ELISA不顯色原因

更新時間:2017-06-28   點擊次數:3321次

    據客戶鄭老師提出的技術問題,上海恒遠公司技術員解說出ELISA不顯示的原因,我公司將重點內容整理出,在這里分享給各位,希望能夠給您的ELISA試劑盒實驗帶來幫助。

問題描述:以前是空白值太高,現在是所有的孔讀值都在0.09左右(空白孔也是),哪里都檢查了,不知道是哪一步錯了。我的步驟是這樣的:
    采用間接ELISA檢測抗血清效價。
    用pH 9.6, 0.15 mol.L-1的碳酸鹽緩沖液將純化的重組蛋白稀釋為8、2、0.5μg·mL -1 , 包被酶標板, 每孔100μL, 4℃包被過夜。次日每孔加入100μL 7%的山羊血清封閉液, 37℃封閉2h后, 用PBST洗滌3次。然后每孔加入400、800、1600、3200倍稀釋的羊抗血清100μL, 空白對照為兔抗血清稀釋液( BSA+PBS),37℃孵育1 h后,同上洗滌3次。再次每孔加入100μL HRP標記的羊抗人IgG, 37℃孵育30 min后, 同上洗滌3次。接下來每孔加入100μL TMB顯色液, 37℃避光反應15 min后, 每孔再加入50μL硫酸終止液。zui后,在酶標儀上測450 nm下的OD值。
    不顯色(幾乎沒有藍色),后來用以前的ELISA試劑盒剩下的TMB,就顯色,TMB是新的,沒有問題,而且我用二抗加TMB后反應藍色,這應該是TMB和二抗都沒有問題吧?真不知道是哪里的原因了。

恒遠技術:請問您包被的重組蛋白是人源的?如果是人源的,那么您加的二抗是羊抗人,這樣測得的結果是不是不準確。間接法的二抗似乎應該和您的待測抗體結合。所以是不是應該選擇HRP標記的X抗羊抗體?

鄭老師:我不太理解您的意思,我做的包被的重組蛋白是人源的,待測抗體是lgG類的,二抗是抗lgG的HRP標記的抗體。

恒遠技術:您做的是間接法,包被抗原是人源,待測抗體是羊源抗人,那么酶標二抗應該與待測抗體結合而不是包被的抗原,所以應該是其他種屬抗羊抗體。因為看了您的敘述我感覺您的抗體種屬可能有問題。本底太高是不是封閉液有問題。換BSA或者脫脂奶粉可以試一下。

鄭老師:嗯,我前面可能敘述有誤,待測抗體是人血清中的抗體。謝謝您的解答!

恒遠技術:不用謝!

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