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western blot 常見(jiàn)問(wèn)題及解決辦法

更新時(shí)間:2019-10-29   點(diǎn)擊次數(shù):2554次

     我們?cè)谧鯳B時(shí)zui常遇到的問(wèn)題也是驚人的相似——樣品漂浮、蛋白條帶扭曲(無(wú)法準(zhǔn)確判斷蛋白分子量)、轉(zhuǎn)膜后看不到帶藍(lán)色或橙色的指示條帶、抗體孵育不均勻?qū)е缕毓舛炔町惡艽螅ㄒ廊皇菚?huì)影響到蛋白表達(dá)量的估算)。

     這些問(wèn)題其實(shí)都或多或少與樣品前處理有關(guān)。也就是說(shuō),我們*可以通過(guò)優(yōu)化樣品處理手法,以及經(jīng)驗(yàn)累積,來(lái)獲得的WB結(jié)果。

     1.出現(xiàn)樣品漂浮怎么辦??

     原因分析:樣品中含有未除凈的溶劑或雜質(zhì),其密度比電泳緩沖液小

     解決辦法:處理組織或菌體時(shí),需充分分散或裂解,確保目的蛋白盡可能的釋放;
     熱處理粗樣時(shí),確保升溫迅速,并且金屬浴或水溫的實(shí)際溫度達(dá)到100℃(在海拔較高處水的沸騰不能確保溫度);
     離心的轉(zhuǎn)速和時(shí)間足夠;
     吸取上清液時(shí)盡量不要碰到中間層

     2.蛋白條帶出現(xiàn)扭曲怎么辦?

     原因分析:分離膠的濃度與蛋白分子量不對(duì)應(yīng);灌膠時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或過(guò)短,導(dǎo)致丙烯酰胺的交聯(lián)度不均勻

     解決辦法:根據(jù)目的蛋白的分子量選擇正確的分離膠濃度;
制備分離膠與濃縮膠時(shí),應(yīng)保證緩沖液母液的正確稀釋,以及各組分的充分混勻(僅用移液器吹吸是不夠的,可以迅速用磁力攪拌器進(jìn)行混勻)

     3.轉(zhuǎn)膜后沒(méi)有指示條帶怎么辦?

     原因分析:如果此時(shí)SDS-PAGE膠上也沒(méi)有指示劑,則表明轉(zhuǎn)膜時(shí)間過(guò)長(zhǎng),蛋白穿膜(此時(shí)就沒(méi)有再繼續(xù)做下去的必要了)

     解決辦法:注意控制轉(zhuǎn)膜時(shí)間;
電泳液反復(fù)使用也可能導(dǎo)致轉(zhuǎn)膜失敗

     4.抗體孵育不均勻怎么辦?

     原因分析:孵育時(shí)振蕩搖床轉(zhuǎn)速過(guò)快,或是混勻直徑不夠,導(dǎo)致孵育不充分或不均勻

     解決方法:確保搖床可以在50 rpm穩(wěn)定運(yùn)行;選擇振蕩直徑在5~10 mm范圍內(nèi)的搖床

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