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酶聯免疫吸附(ELISA)實驗操作步驟

更新時間:2020-12-09   點擊次數:6238次

一、實驗方法原理
本法首先也是用特異性抗體包被于固相載體,經洗滌后加入含有抗原之待測樣品,如待檢樣品中有相應抗原存在,即可與包被于固相載體上的特異性抗體結合,經保溫孵育洗滌后,即可加入酶標記特異性抗體,再經孵育洗滌后,加底物顯色進行測定,底物降解的量即為欲測抗原的量。
 
這種方法欲測的抗原必須有兩個可以與抗體結合的部位,因為其一端要包被于固相載體上的抗體作用,而另一端則要與酶標記特異性抗體作用。因此,不能用于分子量小于5000的半抗原之類的抗原測定。我們用在霍亂腸毒素的測定。HbSAg及HbS的測定。

二、實驗材料
1.樣本:血清 血漿 體液
2.試劑、試劑盒:碳酸鹽包被緩沖液 抗體球蛋白 吐溫 檸檬酸 硫酸
3.耗材:酶標比色計 96孔板 移液槍 離心管 離心管盒

三、實驗步驟
1.包被抗體:用包被緩沖液稀釋特異性抗體球蛋白至適濃度(1~10 ug /ml),每凹孔加0.3 ml,4℃過夜,或37℃水浴3小時,貯存冰箱。
 
2.洗滌:移去包被液,凹孔用洗滌緩沖液(含0.05%吐溫-20)洗3次,每次5分鐘。
 
3.每凹孔加入0.2 ml用稀釋緩沖液稀釋的含抗原的被檢標本,37℃作用1~2小時。
 
4.洗滌:移去包被液,凹孔用洗滌緩沖液(含0.05%吐溫-20)洗3次,每次5分鐘。
 
5.加入0.2 ml用稀釋緩沖液稀釋的酶標記特異性抗體溶液,37℃作用1~2小時或由預試實驗確定作用時間。
 
6.洗滌:移去包被液,凹孔用洗滌緩沖液(含0.05%吐溫-20)洗3次,每次5分鐘。
 
7.加入0.2ml底物溶液于每個凹孔(OPD或OT),室溫作用30分鐘(另作一空白對照,0.4 ml底物加0.1 ml終止劑)。
 
8.加終止劑:每凹孔加2M H2SO4或2 M檸檬酸0.05 ml。
 
9.觀察記錄結果:目測或用酶標比色計測定(OPD用492nm)OD值。

四、注意事項
1.可溶性抗原或抗體吸附于固相載體而成為不溶形式,這是進行酶標記測定的基本條件。許多物質可作為固相載體,如纖維素、交聯右旋糖苷、聚丙烯、聚乙烯及聚氯乙烯等等。但在ELISA中
常用的是聚苯乙烯或聚氯乙烯微量反應板及塑料管。

2.包被所用的抗原必須是可溶性的,而且要求是優質和穩定的制劑,純度和免疫原性要高。如果不純,由于抗原中所含雜質就會競爭固相載體上的有限位置,降低敏感性和特異性。此外還應考慮到制備包被抗原不應破壞其免疫學活性。


3.對某些抗原必須進行提純,如病毒的組織培養和雞胚培養物以及病毒接種動物的臟器等,它們當中存在著許多非抗原的蛋白質,必須設法除去,常用梯度超速離心或親和層析法提純,不經提純是不能使用的。

4.用適稀釋度抗原,包被固相載體不僅經濟,而且可以克服前帶現象。可通過棋盤滴定法進行測定,但用單項滴定法更為簡便,其方法是將抗原進行一系列稀釋包被微量反應板,再用一定稀釋度的陽性參考血清和陰性參考血清進行孵育后洗滌,再加酶結合物進行反應,經孵育洗滌后,加底物溶液顯色,終止反應后分別測定OD值,選擇OD值≥1.0的那個抗原稀釋度為適包被濃度。一般總是要選擇那個OD值稍大于1.0,而不選擇小于1.0的抗原濃度。陰性參考血清OD值要求<0.1-0.2。也就是要求陽性參考血清和陰性參考血清的OD值有明顯差別。

 




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