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關于免疫組化你必須要知道的

更新時間:2021-02-23   點擊次數:2561次

      免疫組化,是應用免疫學基本原理——抗原抗體反應,即抗原與抗體特異性結合的原理,通過化學反應使標記抗體的顯色劑(熒光素、酶、金屬離子、同位素)顯色來確定組織細胞內抗原(多肽和蛋白質),對其進行定位、定性及定量的研究,稱為免疫組織化學技術(immunohistochemistry)或免疫細胞化學技術(immunocytochemistry)。今天上海恒遠為大家整理了一些一些免疫組化的常見問題,下面我們來看看吧!

 1.在什么情況下使用TritonX-100?

(1)Triton X-100 化學名稱為聚乙二醇辛基苯基醚,是一種去污劑。在免疫組織化學(>10um 厚切片)和免疫細胞化學中一般用Triton X-100作為細胞通透劑,在膜上打孔。

(2)其作用原理:Triton X-100可以溶解細胞膜、細胞核膜、細胞器膜上的脂質而使抗體及大分子結構的物質進入胞漿和胞核內,故在細胞免疫組化時尤為推薦使用,這樣抗體就能順利進入胞內與相應抗原結合。

(3)Triton X-100既是一種表面活性劑,也有抗氧化作用

2.封閉血清的選擇原則是什么?

(1)膜上或切片上有剩余的位點可以非特異性吸附抗體,造成后續結果的假陽性!(2)封閉血清一般是和二抗同一來源的,血清中動物自身的抗體,預先能和組織中有交叉反應的位點發生結合,否則在后面的步驟中如果和二抗發生結合,會造成背景。(3)也可以用小牛血清、BSA、羊血清等,但不能與一抗來源一致。

3.抗體孵育條件的比較?

(1)一抗孵育溫度有幾種:4度、室溫、37度,其中4度效果→佳;孵育時間:這與溫度、抗體濃度有關,一般 37 度 1-2 h,而4度夜和從冰箱拿出后 37 度復溫 45 min。(2)二抗一般室溫或 37 度 30 min-1 h,具體時間需要摸索。

4.一抗 4 度孵育后為什么要進行 37 度復溫?

(1)一方面,防止切片從 4 度直接放入 PBS 易脫片;(2)另一方面,使抗原抗體結合更穩定。一般不需要, 但對表達較弱的抗原可能有用,4 度和 37 度時分子運動方式不同, 前者分子碰撞機率和運動速度小于后者, 后者結合更快, 但敏感性也提高了并易造成非特異染色。(3)其實,我更贊同后一種說法,因為我嘗試把肝臟片子從 4 度夜拿出后,直接用 PBS 洗沒發生過脫片現象。事實勝于雄辯! 

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