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你們了解雙抗夾心ELISA法嗎?

更新時間:2022-10-10   點擊次數:764次

雙抗夾心ELISA法是指講特異性針對代測抗原的抗體包被于96孔微孔板中,制成固體載體,向微孔中分別加入標準品或標本,其中代測抗原連接于固相載體的抗體結合,然后加入生物素化的針對代測抗原的抗體,形成夾心,將未結合的生物素化抗體洗凈后,加入HRP標記的親和素,再次*洗滌后加入TMB底物顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉化成藍色,并在酸的作用下,轉化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的待測抗體原正相關。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度(O.D.值),用于樣本中待測抗原濃度測算。

 

1.材料與儀器

1) 包被緩沖液 (pH 9.6 0.05 M 碳酸鹽緩沖液)

2)洗滌緩沖液 (pH 7.40.15 M PBS

3)稀釋液

4)終止液(2 M H2SO4

5)底物緩沖液 (pH 5.0

6)四甲基聯苯胺(TMB)使用液

722’-連氮基--3-乙基-苯丙噻唑啉磺胺(ABTS)使用液

8)抗原、抗體和酶標記抗體:按說明書處理。

9)標準品:用稀釋液稀釋成梯度濃度溶液。

1096 孔聚苯乙烯塑料板 (酶標板)。

 

2.步驟

將特異性抗體與固相載體連接,形成固相抗體:洗滌除去未結合的抗體及雜質。

 

加受檢標本:使之與固相抗體接觸反應一段時間,讓標本中的抗原與固相載體上的抗體結合,形成固相抗原復合物。洗滌除去其他未結合的物質。

 

加酶標抗體:使固相免疫復合物上的抗原與酶標抗體結合。*洗滌未結合的酶標抗體。此時固相載體上帶有的酶量與標本中受檢物質的量正相關。

 

加底物:夾心式復合物中的酶催化底物成為有色產物。根據顏色反應的程度進行該抗原的定性或定量。

 

根據同樣原理,將大分子抗原分別制備固相抗原和酶標抗原結合物,即可用雙抗原夾心法測定標本中的抗體。

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