諾如病毒ELISA檢測(cè)方法步驟

一、標(biāo)本的采集和儲(chǔ)存

出現(xiàn)癥狀后72小時(shí)內(nèi)采樣。
糞便量盡量不少于5ml。
貯存于2～8℃，但zui多不能超過(guò)3天；長(zhǎng)期貯存應(yīng)在－20℃或－70℃。
成形便和肛拭子診斷意義較小。

二、所需材料

　IDEIA™ norovirus試劑盒（DakoCytomation公司）
     1000µl和200µl微量加樣槍及相應(yīng)不帶濾芯的槍頭
     酶標(biāo)儀
     洗板機(jī)
     吸水性能好的衛(wèi)生紙
     去離子水（無(wú)須高壓）或蒸餾水
     渦漩震蕩器
     離心機(jī)
     50ml管、1.5ml EP管及相應(yīng)的架子

三、檢測(cè)前準(zhǔn)備

將試劑和待檢測(cè)標(biāo)本置于室溫（15～30℃）30min。
     陰性對(duì)照：將1ml樣品稀釋液（sample diluent）加至標(biāo)記好的小瓶中作為陰性對(duì)照。
     陽(yáng)性對(duì)照：1ml陽(yáng)性對(duì)照液（positive control）溶解一瓶陽(yáng)性對(duì)照， 顛倒混勻。未用完的陽(yáng)性對(duì)照可在2～8℃貯存1個(gè)月，長(zhǎng)期貯存應(yīng)分裝存于-20℃。
     每次檢測(cè)均至少一個(gè)陽(yáng)性對(duì)照和一個(gè)陰性對(duì)照。
     空白對(duì)照：空氣
     洗液的配制：1倍體積的洗液濃縮液（WASH BUFFER×25）加24倍體積的去離子水，當(dāng)天用當(dāng)天配。

四、標(biāo)本準(zhǔn)備

加入1ml樣品稀釋液至1.5ml 小離心管中，然后，加入0.1g固體糞便標(biāo)本或0.1ml液體糞便標(biāo)本，置于漩渦震蕩器充分混勻，室溫靜置10min，室溫下≥5000rpm離心5min，取上清進(jìn)行檢測(cè)或置-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

五、檢測(cè)步驟

1、將需要數(shù)量的微孔板置于微孔板架上。

2、每孔加入100µl 10％便懸液以及陰性對(duì)照，陽(yáng)性對(duì)照。

3、每孔加入2滴（或100µl）酶結(jié)合物（conjugate），用槍頭輕柔混勻（上下5次左右），20～30℃靜置60±5min。

4、每孔加入350µl洗液（用手輕微搖動(dòng)1 min左右），棄去洗液，在衛(wèi)生紙上拍干，共洗5次。

5、每孔加入2滴（或100µl）底物液（Substrate），20～30℃靜置30min。待藍(lán)色顯現(xiàn)后迅速觀察顏色。

6、每孔加入2滴（或100µl）終止液（Stop solution），充分混勻。

7、讀取OD450值，打印輸出或記錄值。結(jié)果必須在加入終止液后30min內(nèi)讀取。

六、結(jié)果判定

陰性對(duì)照：肉眼觀察無(wú)色或OD450值<0.15。

陽(yáng)性對(duì)照：肉眼觀察呈現(xiàn)*的藍(lán)色或OD450值>0.50。

臨界值（cut-off value）：OD450值＝陰性對(duì)照OD450值＋0.10。

標(biāo)本：

a）肉眼觀察藍(lán)色比陰性對(duì)照顏色深判定為陽(yáng)性，肉眼觀察無(wú)色判定為陰性。

b）OD450值大于臨界值判定為陽(yáng)性，小于臨界值判定為陰性，OD450值在臨界值±0.01

范圍內(nèi)判定為可疑，應(yīng)重復(fù)檢測(cè)或重新取樣。判斷陰陽(yáng)結(jié)果按上述方法進(jìn)行。若OD450值在臨界值仍在±0.01范圍內(nèi)，仍判定為可疑，對(duì)于可疑樣品應(yīng)用PCR方法來(lái)判定zui終結(jié)果。

七、注意事項(xiàng)

1、便標(biāo)本處理時(shí)震蕩時(shí)應(yīng)充分震蕩，特別是成形便或稀便，以便于病毒從標(biāo)本中釋放出來(lái)。

2、加酶結(jié)合物（conjugate）后應(yīng)用槍頭輕柔混勻（上下5次左右），以便于抗原抗體充分結(jié)合。

3、讀取吸光度應(yīng)在加完終止液之后30min內(nèi)完成。

4、所有標(biāo)本和陽(yáng)性對(duì)照必須被當(dāng)作具有潛在感染性的物質(zhì)進(jìn)行處理。

5、打開(kāi)后的96微孔板應(yīng)置于可封口的有干燥劑的口袋中貯存于2～8℃，打開(kāi)后6周內(nèi)用完。

6、終止液中含0.46mol/L硫酸，避免接觸到皮膚和眼睛。如果終止液接觸到這些部位立即用水沖洗。

7、底物液避光保存，不使用已經(jīng)變藍(lán)的底物液。

8、避免試劑、金屬離子、氧化性物質(zhì)及微生物污染。

9、因標(biāo)本中可能存在某些腺病毒，該病毒具有與眼結(jié)膜結(jié)合的能力，在檢測(cè)過(guò)程中應(yīng)避免手與眼的接觸。

10、ELISA板微孔不能反復(fù)使用。

本公司專(zhuān)業(yè)提供原裝RD試劑盒，RB試劑盒，IBL試劑盒，提供免費(fèi)待測(cè)服務(wù)！

 檢測(cè)標(biāo)本：血清或血漿/本產(chǎn)品僅供科研使用

供應(yīng)商：上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司（國(guó)內(nèi)供應(yīng)商）

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