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免疫熒光標記樣品

更新時間:2012-02-21   點擊次數:1875次

用于流式細胞 儀檢測的常用熒光素有FITC、TRITC、Cy3、Cy5,PE和PI,在以上各種熒光染料中,PE熒光zui強,適用于弱表達抗原;FITC*,適用于強表達抗原,適用范圍廣。

1.直接免疫熒光標記法

取一定量的細胞懸液(濃度約1×106 個/ml),直接加入熒光素標記抗體進行免疫反應(如做雙重標記或多重標記染色,可把幾種標記有不同熒光素的抗體同時加入)。4℃孵育15~30分鐘后,用1/15mol/LPBS(pH 7.2~7.4)洗1~2次,加入緩沖液重懸,上機檢測。

本方法操作簡便,結果準確,易于分析,適用于同一細胞群多參數同時測定。雖然直接熒光抗體標記試劑成本較高。但減少了間接標記法中較強的非特異熒光干擾,因此更適用于臨床標本的檢測。

2.間接免疫熒光標記法

取一定量的細胞懸液(濃度約5×106 個/ml),加入特異性*抗體,4℃孵育15~30分鐘,待反應*后用磷酸緩沖液洗去未結合抗體,吸盡殘留液體,再加入熒光標記第二抗體,4~C孵育30分鐘,抗原―抗體―抗抗體復合物,洗滌后即可上機檢測。注意:在整個熒光標記過程中均需參考免疫熒光細胞化學間接法染色程序,尤其是加入一抗前需使用正常非免疫血清封閉,以減少非特異性反應。如果對于未經固定的細胞需使用0.3%TritonX-100為細胞膜打孔,以保證抗體能夠進入細胞內。

此法費用較低,二抗應用廣泛,多用于科研樣品檢測。但是,由于非特異性熒光背景較強,

影響實驗結果,在樣品制備時應加人陰性或陽性對照。另外,由于間接法步驟較多,尤其是經過多次洗滌,均可使細胞數量驟減,因此,在加入*抗體前細胞懸液的細胞濃度約5×106個/ml,上機檢測前不少于1×106 個/ml即可,此法不適用測定細胞數較少的樣品。

3.熒光標記中的注意事項

① 為減少非特異性干擾,熒光標記物用前應用0.22um濾膜過濾或高速離心5分鐘,以除去顆粒或沉渣。

② 細胞樣品的制備、染色及保存均應該盡量保持新鮮,防止分解代謝引起的表面抗原消失及細胞死亡,可以通過加入營養培養基或低濃度血清以及4~0或冰浴中操作來解決。

③ 細胞或低比例細胞亞群分析時,為保證準確,應排除死細胞。

④ 熒光標記抗體濃度應該合適,如果濃度過高,會使非特異性結合增加。在使用一抗之前,將樣品與過量的牛血清白蛋白(BSA)或來源于同一種屬的正常血清一起孵育,以阻斷一抗和細胞表面或胞內結構非特異性作用。在使用一抗之后,將樣品、與二抗相同種屬的5%~10%正常血清和二抗一起孵育,以減少二抗與一抗、細胞表面或胞內結構之間的非特異相互作用。如果使用含有與一抗或二抗種屬相同的血清液體稀釋抗體,便可以省略此步驟。




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