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ELISA實(shí)驗(yàn)的核心三要素:不可-或缺的三大試劑

更新時(shí)間:2025-03-14   點(diǎn)擊次數(shù):275次

一、ELISA基本原理

ELISA通過抗原-抗體的特異性結(jié)合,利用酶催化底物顯色反應(yīng)進(jìn)行定量或定性分析。常見的類型包括直接法、夾心法和競爭法,但其核心步驟均依賴于以下三類關(guān)鍵試劑。


二、核心試劑一:包被抗體/抗原——實(shí)驗(yàn)的“基石"

作用:作為固相載體(微孔板)的固定化分子,捕獲目標(biāo)物。

純度與活性:高純度避免交叉反應(yīng),確保結(jié)合效率(建議使用單克隆抗體)。

包被濃度優(yōu)化:預(yù)實(shí)驗(yàn)確定最佳濃度(通常1-10 μg/mL),濃度過高易導(dǎo)致空間位阻。

緩沖液選擇:碳酸鹽緩沖液(pH 9.6)常用,避免含BSA或Tween的溶液。


常見問題:

非特異性結(jié)合:增加封閉步驟(如5%脫脂牛奶或BSA封閉1小時(shí))。

包被不均:4℃過夜包被優(yōu)于室溫2小時(shí),提高結(jié)合穩(wěn)定性。


三、核心試劑二:酶標(biāo)抗體——信號的“放大器"

作用:與目標(biāo)物結(jié)合后催化底物顯色,將生物學(xué)信號轉(zhuǎn)化為光學(xué)信號。

HRP(辣根過氧化物酶):常用,底物為TMB(顯藍(lán)色)或OPD(顯黃色),靈敏度高。

AP(堿性磷酸酶):底物為pNPP(顯黃色),適用于磷酸鹽緩沖體系。

標(biāo)記效價(jià):高效價(jià)減少用量,降低成本(建議效價(jià)≥1:5000)。

保存條件:HRP需避光保存,避免反復(fù)凍融(分裝后-20℃儲(chǔ)存)。

注意事項(xiàng):

避免與疊氮鈉(HRP抑制劑)共用,可選擇ProClin 300作為防腐劑。


四、核心試劑三:底物顯色系統(tǒng)——結(jié)果的“可視化"

作用:酶催化底物生成有色產(chǎn)物,通過吸光度值定量目標(biāo)物濃度。


常用底物對比:

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優(yōu)化技巧:

顯色時(shí)間控制:室溫避光反應(yīng)10-30分鐘,避免過度顯色導(dǎo)致背景升高。

終止時(shí)機(jī):當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)品最高濃度孔顯色明顯時(shí)立即終止。

 

五、實(shí)驗(yàn)流程關(guān)鍵步驟

包被:100μL/孔,4℃過夜。

封閉:含1% BSA的PBS,37℃1小時(shí)。

加樣:樣本梯度稀釋,37℃孵育1小時(shí)。

酶標(biāo)抗體孵育:37℃1小時(shí),洗滌3次(0.05% Tween-20 PBS)。

顯色與終止:TMB顯色15分鐘,2M H?SO?終止。

讀數(shù):雙波長檢測(450 nm/630 nm校正孔間誤差)。

 

六、常見問題與解決方案

高背景噪音:增加洗滌次數(shù)(5次以上),檢查封閉液是否失效。

低信號值:優(yōu)化包被濃度或延長底物孵育時(shí)間。

孔間差異大:使用多通道移液器,確保加樣一致性。

聯(lián)


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