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細胞DNA轉染方法

更新時間:2013-06-06   點擊次數:2584次

                            細胞DNA轉染方法

 
對于大部分細胞系 DNA與DNAfect的比例在1:21:3時轉染效率較高。為了提轉化效率、達水平并少細胞毒性,實驗應在細胞密度較大時進行轉染。以下操作以24孔板每孔細胞的DNA轉染操作為例。
1.      貼壁細胞轉化前一天在24孔板的每孔中加入500 μl無抗生素的生長培養基并于每孔中接種0.5-2×105個細胞,待細胞長至80-90%滿時進行轉染。
懸浮:在細胞之前,在24板的每孔加入500  μl無抗生素的生養基,并孔中接種3-5×105
個細胞。
2.      轉染當天,首先準備轉染復合物,對于每孔細胞按照以下用量配制:
a.  取適量DNA,加入25 μl無血清培養基,并輕輕的混合均勻。
b.  取適量DNAfect,加入25 μl無血清培養基,輕輕混勻,并于室溫孵育5分鐘。
c.  孵育5分鐘之后,將稀的DNA和稀的DNAfect合(使DNA及DNAfectin的終總體積為50  μl),輕輕 混合均勻,并在室溫下孵育20分鐘(溶液可能會出現絮狀,但不會影響轉染效率) 注意:該混合物在室溫下可以穩定保存6小時。
3.      將步驟1中24孔板中培養的細胞生長培養基更換成450 μl無血清培養基然后將步驟2中50 μl轉染復合物加入到
24細胞孔板內,輕輕前后推動24孔板以混勻。
4.      將細胞置于含5%CO2,37條件下培養4-6小時后,更換成500  μl生長培養基。
5.      18-48小時后進行轉染基因表達的檢測。
6.      對于穩定的細胞系:在轉染24小時后,細胞按照1:10的比例傳代,第二天可加入篩選培養基進行篩選。
(1)  該說明一個24孔的用量若同時轉幾個孔配制轉染復合物的量需加倍若轉染其他類型孔板DNA和DNAfect見附表,該附表用量以293T細胞為轉染細胞時的標準用量。
(2)  轉染4-6小時后可以不更換養基,但由于DNAfect具有細胞毒性,間過長可能使細胞出現大死亡現 象,建議更換生長培養基。
(3)  優化條件:想要得到更高的轉效率,應優化轉條件:培養物、DNA濃度、細胞和細胞與DNA合物的孵育時間條件都 應進行優化。




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