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值得您看:進口試劑盒來說實驗室制取質粒的過程

更新時間:2014-04-08   點擊次數:1102次

    一個春意濃重的清明小假過去啦,今天為止,朋友們開始進入正常的工作狀態中。新的一周中,上海恒遠給大家帶來的一個實驗方法,值得您看:進口試劑盒來說實驗室制取質粒的過程。
    我們知道,質粒是攜帶外源基因進入細菌中擴增或表達的主要載體,它在基因操作中具有重要作用。分離與提取是zui常用、zui基本的實驗技術。
    它的制取方法有很多的,一般情況下來,大多都是包括了細菌的培養、細菌的收集和裂解、質粒DNA的分離和純化這三個步驟。而今天上海恒遠給朋友們講說的實驗中,是以以堿裂解法為例,其中,我們要掌握堿裂解法抽提質粒的原理、步驟及各試劑的作用。 
    所需物品:
1、含有質粒pUC18載體的大腸桿菌菌液
2、克隆有水稻外源片段的BAC的大腸桿菌菌液 
    取過程
1、取含有pUC18質粒的大腸桿菌菌液于LA培養基上37℃過一個晚上培養; 
2、用無菌牙簽挑取單菌落,接種于含有Amp抗生素的LB培養基中,37℃搖床~250 r/min過一個晚上培養; 
3、吸取1.5 ml菌液,12000 g離心2分鐘,收集菌體,倒掉菌液;吸取1.5 ml菌液,再次收集菌體,盡量將菌液倒干凈; 
4、加入300 ml溶液 I振蕩打勻,重新懸浮細胞,震蕩混勻(這里的時候,上海恒遠提醒注意:應*打勻沉淀或碎塊);
5、加入300 ml溶液II,輕柔顛倒混勻,放置至清亮,一般不超過5分鐘; 
6、加入300 ml溶液III顛倒混勻,放置于冰上10分鐘,使雜質充分沉淀; 
7、12000 g離心10分鐘; 
8、吸取800 ml上清液(注意!不要吸取到飄浮的雜質)至另一Eppendorf管中,加入2/3體積的異丙醇,室溫下放置5分鐘; 
9、12000 g 常溫離心15分鐘; 
10、倒盡上清,加75%乙醇浸洗除鹽(放置片刻或離心3分鐘后倒去上清); 
11、室溫放置或超凈臺上風干DNA; 
12、加40 ml滅菌超純水或TE溶解; 
13、質粒、BAC的質量檢測,于-20℃保存. 
    我們這個實驗的主要原理依據是在pH 12.0 ~ 12.6堿性環境中,細菌的線性大分子量染色體DNA變性分開,而共價閉環的質粒DNA雖然變性但仍處于拓撲纏繞狀態。將pH調至中性并有高鹽存在及低溫的條件下,大部分染色體DNA、大分子量的RNA和蛋白質在去污劑SDS的作用下形成沉淀,而質粒DNA仍然為可溶狀態.通過離心,可除去大部分細胞碎片、染色體DNA、RNA及蛋白質,質粒DNA尚在上清中,然后用酚、氯仿抽提進一步純化質粒DNA。
    以上就是今天的的實驗制取方法內容啦,我公司四月的新品進口試劑盒上線啦,均是以七折大賣的,需要的朋友們我公司何。




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