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技術講壇:ELISA試劑盒標準曲線的繪制要點

更新時間:2015-10-14   點擊次數:1718次

許多試劑檢測都涉及到標準曲線的問題,ELISA試劑盒標準曲線做的好與壞會直接影響到實驗的結果,甚至是關系到實驗的成敗,那么究竟如何繪制或制作標準曲線呢?
一、做標準曲線樣品檢測時有幾個問題需要注意
1、樣品的濃度等指標是根據標準曲線計算出來的,所以首先要把做標準曲線看作是比做正式實驗還要重要的一件事,否則后面的實驗結果無從談起。
2、設置標準曲線樣品的標準濃度范圍要有一個比較大的跨度,并且要能涵蓋你所要檢測實驗樣品的濃度,即樣品的濃度要在標準曲線濃度范圍之內,人ELISA試劑盒包括上限和下限。而對于呈S型的標準曲線,盡量要使實驗樣品的濃度在中間坡度zui陡段,即曲線幾乎成直線的范圍內。
3、ELISA試劑盒采用倍比稀釋法配制標準曲線中的標準樣品濃度,這樣就能夠保證標準樣品的濃度不會出現較大的偏離。
4、檢測標準樣品時,應按濃度遞增順序進行,以減少高濃度對低濃度的影響,提高準確性。
5、標準曲線的樣品數一般為7個點,但至少要保證有5個點。
6、做出的標準曲線相關系數因實驗要求不同而有所變動,但一般來說,相關系數R至少要大于0.98,對于有些實驗,至少要0.99甚至是0.999.
二、選擇什么方程去擬合
在S曲線的低濃度部門可以用乘冪方程很好的擬合,中低濃度部門可以用直線方程,中間部門可用對數方程,而中后段可用四參數。免疫檢測時尺度點(可以是倍比稀釋的,也可以不是)濃度假如和相應的吸光度(OD)值假如能夠呈現直線關系當然是的了,這時可以通過EXELL等利便的獲得擬合曲線,進而推算出樣品的濃度值。 
關于尺度曲線的擬合方式,直線、二次曲線、三次曲線、指數、對數等雖都可用于ELISA及其它生物學反應中的曲線擬合,但都只合用于曲線的一部門,有的合用于前半段,有的合用于后半段,有的合用于中間一段,而Logistic曲線則對曲線的全部都有較好的合用性。在一個長的區間內,Logistic應該都能擬合得較為理想。假如用來定量,S形曲線的中間段(較陡處)是比較好的,而兩真個平坦部門計算誤差會大,有時甚至會很大。用于免疫檢測的所謂“尺度曲線"實在稱為擬合曲線比較合適。目前上zui流行的免疫檢測擬合方式是“四參數邏輯擬合",用這種擬合方式往往能夠比較的反映濃度和吸光度的曲線關系,從而進一步比較準確的獲得樣品中待測物質的濃度值。但我們做免疫檢測很少有時候能夠有這么理想的情況,標品濃度和相應OD值往往是"S"型的曲線關系,這時就不能用直線擬合的方式了,而對擬合方法進行選擇就是必要的了。樞紐在于你的尺度曲線做到了S形的哪一部門,你想檢測的樣品濃度在曲線的哪一部門。當然,假如用于定量,仍是在中間一段較好。但建模型是一回事,而用它來定量是另一回事。ELISA試劑盒這些方法固然沒有一種方法可以通用,但也都可以用。但并不是說它就是的。事實上不僅是ELISA,其它良多生物學反應都是S形曲線,也都可以用Logistic曲線擬合。




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