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糖基轉移酶活性分析

更新時間:2012-07-11   點擊次數:1861次

R&D Systems現已開發(fā)出一種多功能的非放射性檢測方法,能測定糖基轉移酶活性。分析使用了一種特定的磷酸酶,它釋放糖基轉移酶反應過程中產生的核苷酸上的磷酸。隨后利用孔雀石綠磷酸鹽檢測試劑來評估磷酸鹽水平。因為釋放的磷酸鹽濃度與轉移的糖分子量成正比,所以可測定糖基轉移酶的動力學參數。此外,這種顯色分析在96孔板中開展,適合高通量研究

 糖基轉移酶是催化單糖基團從糖基供體向受體底物轉移的酶。其中大部分被歸為Leloir酶,它們利用核苷酸糖作為供體,并在反應中核苷酸磷酸鹽。分析糖基轉移酶活性相當具有挑戰(zhàn)性。zui常用的方法是檢測放射性標記的糖從供體轉移到受體分子。各種非放射性的檢測方法也被不斷開發(fā);然而,它們中的大部分是為特定糖基轉移酶定制的。

為了證明這種技術的實用性,我們評估了Clostridium difficile毒素B(TcdB;圖2A)、人O-糖基轉移酶I(KC1;圖2B)和人ST6GAL1(圖2C)的酶活。TcdB和KC1是具有UDP-葡萄糖水解酶活性的糖基轉移酶,它們在反應中副產物UDP。磷酸酶CD39L3水解核苷酸β-磷酸鹽,并從UDP上釋放出游離的磷酸鹽。相比之下,ST6GAL1是唾液酸轉移酶,它催化了N聚糖中唾液酸從α2,6轉移到β 1-4GlcNAc結構。對于此反應,CMP-NeuAc充當供體底物,而N-乙酰乳糖胺(LN)則充當受體。利用5’核苷酸酶CD73從反應中產生的CMP上釋放出游離的磷酸鹽。對于這三種糖基轉移酶的反應,利用孔雀石綠檢測試劑測定游離磷酸鹽水平,以獲得相對供體底物濃度的特定活性(pmol/min/µg)的準確測定(圖2)。




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