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核酸探針技術(shù)簡(jiǎn)介

更新時(shí)間:2012-07-17   點(diǎn)擊次數(shù):3101次
核酸探針技術(shù)
 
    核酸探針(又稱基因探針,gene-probe)技術(shù),是20世紀(jì)晚期在生物學(xué)領(lǐng)域中發(fā)展起來的一項(xiàng)新技術(shù),除可用于病毒、細(xì)菌等微生物的快速診斷外,還可用于研究病毒基因在組織細(xì)胞中的存在,研究基因是以游離的形式還是以整合的方式與宿主細(xì)胞DNA結(jié)合,研究基因在細(xì)胞或組織中的定位等。
 
    (一) 基本原理
    Waston-Crick發(fā)現(xiàn)的DNA雙螺旋模型已為大家所熟知。因?yàn)殡p股DNA是一種非常穩(wěn)定的物質(zhì),于0.3mol/L NaOH 中暴露于60℃下,也不被破壞,在近100℃加熱時(shí),氫鍵雖可破壞,使DNA變成單股,但變性后的單股DNA還可結(jié)合在特定的載體如硝酸纖維素膜上,而標(biāo)記的核酸(DNA或RNA)探針仍能與結(jié)合在膜上的單股DNA通過堿基互補(bǔ)配對(duì)原則形成氫鍵,又恢復(fù)成雙股,此時(shí),或通過放射自顯影來觀察X光片中的特定核酸片段的蹤跡,或通過非放射性物質(zhì)標(biāo)記后,觀察產(chǎn)生的特異顏色,以確定特定核酸片段的蹤跡。使單股重新聚合成雙股的過程稱為退火或復(fù)性,不同來源DNA分子之間的退火,則形成雜交。應(yīng)用這種雜交技術(shù)可用以檢測(cè)和鑒定任何病毒或細(xì)菌的DNA分子等,核酸分子雜交可在DNA-DNA、DNA-RNA、RNA-RNA之間進(jìn)行。根據(jù)雜交程度,可判斷兩個(gè)核酸分子之間核苷酸順序同源性的多少。
 
    (二) 核酸探針檢驗(yàn)的特點(diǎn)
    雙股RNA比雙股DNA更穩(wěn)定,雜交后,經(jīng)嚴(yán)格沖洗,可洗去非特異結(jié)合的探針,還可用RNA酶來降解未雜交的RNA,小的RNA分子比大的DNA分子更易擴(kuò)散進(jìn)入薄膜,在原位雜交中獲得更大的信號(hào)與本底比率(signal to noise ratio),由此可見,用核酸探針檢測(cè)具有很大的優(yōu)點(diǎn)。
     對(duì)于不易分離培養(yǎng)的微生物標(biāo)本,及大量培養(yǎng)增殖后有“危險(xiǎn)性”的病毒標(biāo)本,均可用核酸探針直接檢測(cè)。另外,對(duì)病毒子或病毒抗原太少的標(biāo)本,不易用常規(guī)方法,包括電鏡和血清學(xué)方法檢測(cè)的標(biāo)本,也可用核酸探針檢測(cè)。本法還可用于對(duì)變異株病毒等的鑒定。
 
    (三) 核酸探針的發(fā)展前景
    近年來,隨著人們對(duì)基因精細(xì)結(jié)構(gòu)的深入細(xì)致的研究和DNA合成技術(shù)的發(fā)展,已經(jīng)能夠人工合成寡聚核苷酸片段作為探針來使用。這樣由于DNA探針來源比較豐富,所以,可提高探針濃度來縮短雜交時(shí)間。Rubin等用Whatman 541濾紙代替硝酸纖維素膜進(jìn)行菌落雜交試驗(yàn),使操作過程方便簡(jiǎn)單,并且可取消預(yù)雜交。非放射性標(biāo)記物——生物素,正日益引起人們極大的興趣,是今后的發(fā)展方向。

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